张家界新增本土确诊病例(张家界新增本土确诊病例多少)

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摘要： 　　iTRAQ技术是目前比较成熟且常用的定量蛋白质组学技术，在寻找疾病蛋白质biomarkers的研究中经常用到该技术。寻找蛋白质biomarkers的研究经常分为两部分：一为通过...

　　iTRAQ技术是目前比较成熟且常用的定量蛋白质组学技术，在寻找疾病蛋白质biomarkers的研究中经常用到该技术。寻找蛋白质biomarkers的研究经常分为两部分：一为通过差异定量的方法高通量筛选，并利用生物信息学的手段缩小候选验证的范围；二为利用各种验证手段对前期高通量筛选的结果进行验证，筛选出最具有潜力的候选biomarkers，以供更进一步地临床分析。

　　本篇文献里作者先是采用基于质谱的高通量定量蛋白质组学技术——iTRAQ，筛选出与结肠癌诊断相关的biomarkers，接着分别通过免疫组化、QPCR、多例病例的数据集等研究对筛选的候选蛋白质biomarkers进行验证，最终认为LOXL2是最具有潜力的诊断标志物。

　　文献来源：LOXL2 is highly expressed in cancer-associated fibroblasts and associates to poor colon cancer survival. Clin Cancer Res. 2015 Jul 23. pii: clincanres.3096.2014.

　　对结肠癌发展不同阶段的正确区分（尤其是II期和III期），迫切需要寻找到足够多的诊断标志物。肿瘤相关的成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境的主要参与者，与肿瘤的复发和存活密切相关。作者利用蛋白质组学技术（iTRAQ）分析了从肿瘤病人组织中分离纯化出的结肠癌相关成纤维细胞（CAFs）与正常成纤维细胞（NFs）的蛋白表达差异，发现大量间质相关蛋白可能作为诊断标志物。其中LOXL2和TAGLN表现出很强的诊断价值，LOXL2的高表达与较差的预后直接相关，并能够很好地指针高风险的II期和III期病人。LOXL2可能在临床应用中具有很好的风险评估潜力，有利于判断后续治疗策略及改善最终的预后。

　　收集12对结肠癌病人的肿瘤组织及癌旁组织，将肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）与正常成纤维细胞（NFs）进行纯化分离，利用4-Plex iTRAQ对成纤维细胞的细胞上清和胞内蛋白进行差异蛋白质组学分析。

　　差异表达的间质相关蛋白随后进一步利用免疫组化进行验证。预后诊断潜力评价过程中，① 外源基因表达数据集（共包含超过300例病人的数据）被用于进行训练和风险界定，② 70例病例组织的PCR结果以及 ③ 121例病例组织的免疫组化结果被用于进行验证。整合的数据集被用于对II期和III期病人进行风险预测。

iTRAQ workflow used for the proteomic analysis of CAFs and NFs.

CM: Cell Conditioned Medium WCE: Whole Cell Extract

　　iTRAQ分别鉴定到1780个胞内和305个细胞上清蛋白，其中分别有57 和43蛋白具有表达差异，作者选择了其中15个差异表达蛋白进行了WB和PCR验证。体外培养的成纤维细胞经TGF-β刺激后，表现出了相似的蛋白表达谱。

Proteins identified and quantified in both iTRAQ replicates.

Figure 1. Validation of CAFs deregulated proteins.

　　（以下几段均为通过不同方法对iTRAQ结果中筛选的差异蛋白进行验证）

　　为了分析这些差异表达蛋白的细胞表达特异性，作者采用了GSE39396 dataset（从6个结肠癌病人分离得到的4种细胞endothelial cells: CD31+, epithelial cells: EPCAM+, inflammatory cells: CD45+ and CAFs: FAP+）进行了初步分析，发现其中60个上调表达蛋白中的28个蛋白，以及40个下调表达蛋白中的24个蛋白，与成纤维细胞的高表基因状态一致。

　　接下来，作者用QPCR的方法分析了这些蛋白在KM12C、KM12SM、SW480 和SW620上皮结肠癌细胞系中的基因表达，发现其中的10个蛋白特异性地或者过表达于成纤维细胞中。

　　免疫组化试验进一步证实，ACAN、αSMA、CDH13、DKK3、TAGLN、TGM2和LOXL2均选择性表达于结肠癌间质中，而在上皮或正常的结肠黏膜中不表达或无规律性表达。这些结果说明，筛选出的蛋白具有作为特异性肿瘤间质标志物的价值。

Figure 2. Stromal specificity of CAFs proteins.

Figure 3. Expression of stromal biomarkers in paired tissues of colon cancer patients.

　　为了评估这些蛋白是否能够指针疾病的复发风险和预后，作者首先在一个由70例结肠癌病人组成的队列中进行了验证。肿瘤组织中的LOXL2表达水平比正常组织高出44%，LOXL2的高表达与整体存活（P = 0.001 HR: 8.52 (1.90-38.29)）和高复发率（P = 0.001 HR: 5.38 (1.70-17.01)）一致。

　　多变量统计分析数据集的结果证实，LOXL2的表达水平与较差的预后相关，并可作为一个独立的无疾病存活和整体存活的预后因子（Table 1）。

　　随后，另外一批121个结肠癌病人的免疫组化结果进一步证实，大约32%的病人表现出较强的LOXL2表达（>50%的阳性标记），间质细胞核的阳性标记与无疾病存活和整体存活有关。将LOXL2和其他标志物进行组合诊断，并不能明显提高诊断能力。

Figure 4. Prognostic value of LOXL2 and TAGLN in colon cancer.

　　为了评价LOXL2对II期和III期病人的风险评估价值，作者采用多个数据集分析了II期病人的复发率与表达水平的关系。结果发现，LOXL2高表达的II期病人的复发周期更短（P value = 0.011 HR: 2.74 (1.22-6.20)），其三年DFS为73.9%，而低表达组为89.6%。高表达LOXL2的47例II期和III期病人的无病期更短。55个II期病人的免疫组化结果显示，其无病期为P= 0.005 HR: 4.35 (1.43-13.25)。LOXL2高表达也与III期病人的整体存活（P = 0.004 HR: 3.40 (1.40-8.24)）有关。